前言

与药物结合百分比（PPB）相关的监管指南通常将药物相互作用（DDI）预测的PPB阈值设定为1%，这是由于强结合化合物的结合比率难以精确检测所致。然而，指南中很少提供关于PPB方法的具体建议或细节。什么类型的化合物应该采用什么样的PPB检测方法，目前业界缺乏这样的共识。

罗氏详细研究了三种主要的PPB方法（HTD、UC和UF）最终制定了决策树；但是当这些标准方案不适用时，可能需要进一步开发新方法。

 

1. 建立可靠的血浆蛋白结合测试方法的必要性

我们都明白，准确测量 PPB 至关重要，因为它会影响药代动力学/药效学 (PK/PD) 关系、治疗窗以及潜在药物相互作用 (DDI) 风险的评估。

但是，罗氏的研究人员还特别提到了在临床试验中，研究游离药物的全身暴露如何影响特定人群（例如肝肾功能不全患者和儿科患者）的药代动力学和剂量-反应关系的重要性，因为PPB 的差异在特殊人群中十分常见，疾病状况和幼儿的发育阶段会改变血浆蛋白（如白蛋白和α1-酸性糖蛋白）的水平。

例如，苯妥英钠的结合率相对较高（游离苯妥英钠<10%），且治疗窗较窄。因此，在低白蛋白血症的危重患者中，苯妥英钠游离分数的增加会增强其药理活性并增加毒性风险，这凸显了密切监测治疗药物的必要性。因此，建立可靠的血浆蛋白结合率(PPB) 测定方法，并收集日益可靠的数据，以支持从早期发现到后期药物开发阶段的决策，至关重要。

最后，对于中等结合率的药物，20% 与 25% 之间的差异微乎其微，远低于两倍；而对于高结合率的药物，报告值看似微小的变化（例如 0.1% 与 1%）却反映了游离药物浓度和药理学有效浓度的十倍增长。所以对业界而言，存在着对高蛋白结合率药物测试方法的局限性以及使用的科学性。

 

2. 血浆蛋白结合测试方法优缺点

在几种测试 PPB 的方法中，最常用的是平衡透析 (ED/HTD)、超滤 (UF) 和超速离心 (UC)。每种方法都各有优缺点。

方法

优势

缺点

平衡透析

高通量、易于自动化、应用广泛、血浆用量少

化合物依赖性扩散限制和平衡时间。可能低估未结合百分比。孵育时间过长，可能导致不稳定化合物的非特异性结合。

超滤

孵育时间短

存在非特异性结合的可能性。高亲脂性化合物可能无法穿过细胞膜。通量低。

超速离心

化合物分离不依赖于截留分子量膜。适用于高分子量化合物。

“无蛋白”样品超速离心中可能残留血浆蛋白，化合物可能发生沉淀，通量低，采样复杂，需要专用设备。

 

3. 血浆蛋白结合测试方法的计算公式

3.1 常规方法

1. HTD平衡透析法

HTD后血浆中游离药物的百分比按以下方法测定：

 

 

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其中 C acceptor和 C donor分别是透析后受体（缓冲液）隔室和供体（血浆）隔室中的浓度。

实验回收率按以下方式计算：

 

 

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其中，V acceptor和V donor分别代表供体（血浆）室和受体（缓冲液）室的体积，C0为透析前血浆中的浓度。同样的方程也应用于HTD中的扩散试验。

2. UF超滤法

超滤后血浆中游离药物的百分比按以下方法测定：

 

 

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其中 C超滤液为离心后超滤液（下室）中的浓度。

实验回收率按以下方式计算：

 

 

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其中 C0为超滤前血浆中的浓度，V0为实验开始时加入上室的体积，C donor为离心后上室（血浆）中的浓度，V donor和 V ultrafiltrate分别为离心后上室和下室中剩余的体积。

3. UC超离法

UC后血浆中游离药物的百分比按以下方法测定：

 

 

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其中 C ultracentrifugate是超速离心后无蛋白质中间层的浓度。

超离法这点不好，无法像前两种方法一样，实测回收率。

3.2 使用稀释血浆

当使用稀释血浆时，稀释校正因子假设为线性（非浓度依赖性结合），外推的未结合百分比计算如下：

 

 

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其中 D 为血浆稀释因子。

注意：假如要用稀释血浆去测的话，还是提前确定好公式，别用错了。另外，稀释法是不是以上三种方法都可以用，这个也不确定，能确定的是平衡透析法是可以用的。大家提前去了解一下。

3.3 化合物不稳定或者非特异性吸附时

由于UF和UC方法中不稳定或NSB造成的化合物损失按如下方式计算：

 

 

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其中 C final是 UF 20 分钟后或 UC 2 小时后测得的浓度，C 0是初始血浆浓度。

3.3 验收标准

三种方法的数据分析均遵循既定的验收标准。

在HTD、UC或UF条件下，若回收率或剩余百分比低于50%或高于120%，则数据无效。所有化合物均进行三次重复实验，且平均游离百分比值的变异系数（CV）必须低于30%。

在所有实验中均加入地西泮，作为单独的孵育物，并用作所有方法中的对照化合物，预计其在人血浆中的游离百分比为0.7%至3.0%。孵育后，使用BCA蛋白测定试剂盒定量无蛋白样品中的蛋白浓度。HTD中蛋白浓度超过0.4 mg/mL或UF和UC中蛋白浓度超过0.8 mg/mL的样品均被视为污染，不纳入计算。

上述是罗氏自己的标准，大家可以自己确定自己的质量标准，罗氏的研究可以参考。

 

4. 罗氏的研究结果

4.1 化合物测试数据

化合物集包含26种已上市和在研化合物，其游离百分比值范围很广（0–100%），理化性质也各不相同，包括分子量（236–1465）、电离度、LogP值（-2.30–8.28）、pH 7.4时的LogD值（-0.84–4.10）以及氢键供体（0–5）和受体（3–28）的数量；所选化合物既包括符合bRO5的化合物，也包括不符合该规则的化合物。此外，根据文献报道的fu值（fu < 10%），选择了一些上市化合物，使其处于相似的预期结合范围内，其中超过60%的化合物具有高结合力（fu < 1%）。所有文献值均来自DIDB数据库。

 

 

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除拉帕替尼、尼卡地平和孟鲁司特外，大多数化合物的游离百分比值基本一致。拉帕替尼、尼卡地平和孟鲁司特在不同方法间测得的游离百分比值差异大于2倍，其中UC法测得的游离百分比值高于其他方法（表1，图1C）。

虽然所有化合物的数据均已列出以便直接比较不同方法，但根据典型的检测验收标准，对于HTD回收率低（如dipyridamole）或在UF或UC中剩余百分比低（<50%）（如RO1和孟鲁司特）的化合物，其游离百分比值的可靠性较低。虽然预计UF法不会出现稳定性问题，但亲脂性化合物拉帕替尼、双嘧达莫、孟鲁司特和酮康唑的回收率较低，这可能是由于非特异性结合（NSB）所致（表1）。实验间变异性极小，地西泮对照数据符合验收标准。

 

 

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使用首选初始方法HTD测得的蛋白质结合数据与先前报道的文献数据高度相关（R² = 0.97；图1A）。此外，HTD数据与测得的UF值（R² = 0.95；图1B）和测得的UC数据（R² = 0.95；图1C）均表现出极佳的一致性。

这一结果与三种不同比较方法中大多数值（≥ 84%的化合物）彼此相差不超过两倍的情况相符。最后，三种评估方法之间的实验室间差异有限。这表明不同方法之间以及不同实验室之间具有高度一致性，提示在满足各自的验收标准时，HTD、UF和UC可以可靠地互换使用，用于测定各种化合物的游离百分比。

4.2 血浆蛋白结合的决定因素

对初始测试化合物集进行的血浆蛋白结合率测定显示，游离百分比值范围很广，从0%到100%不等（表1，图1）。亲脂性化合物的游离率往往呈负相关，即LogD > 3的化合物的游离百分比<1%（环孢素A除外），而亲水性更强的化合物的结合率通常较低（表1）。将我们测得的HTD值与预测的LogD值进行比较，结果显示二者呈负相关（R² = 0.68）。血浆蛋白结合率与以下理化性质均无相关性（R² < 0.60）：水溶性、pKa、分子量、电荷、极性表面积、氢键受体或供体的数量。

4.3 高结合率或bRo5 化合物的血浆蛋白结合方法

在评估了小分子固有方法性能后，罗氏进一步评估了优化条件是否能够提高bRo5和高结合率化合物测量的可靠性。

罗氏使用改进的HTD、UC以及Transil方法进行了PPB测量，以评估一系列bRo5化合物，尤其关注高结合率化合物。

1. HTD改良型方法

为了评估高结合或bRo5化合物，对HTD方法进行了调整，降低未达到平衡的风险，HTD孵育时间从5小时延长至16小时。使用50%的人血浆（用Sørensen缓冲液1:1稀释），并在受体室中用含有0.01% Solutol®的Sørensen缓冲液进行透析（使用0.01% Solutol®以提高溶解度并减少HTD受体室中的非特异性结合（NSB））。在相同的孵育条件下，使用含有 0.01% Solutol® 的 Sørensen 缓冲液在透析膜的两侧进行额外的扩散测试，以评估 bRo5 分子是否能够通过透析膜实现 > 70% 的扩散。

2. UC改良型方法

UC方法也采用50%血浆稀释，以提高测量低浓度游离药物的可能性。

3. Transil试剂盒方法

Transil人血清白蛋白 (HSA) 试剂盒和 Transil 高灵敏度结合 (HSB) 试剂盒用于测定部分高结合率化合物和 bRO5 化合物。

两种试剂盒均采用 96 孔板形式，孔内含有不同浓度的血浆或 HSA 稀释液以及包被有特异性结合基质的微珠，以便药物快速平衡，并根据其与血浆蛋白的结合亲和力估算未结合分数。

Transil 操作按照试剂盒制造商 (Sovicell) 的说明进行。分别使用 HSA 和 HSB 试剂盒评估了 12 种环肽和 12 种市售化合物。数据由两种试剂盒生成，使用的 HSA 或血浆浓度范围（预先确定），该范围基于膜亲和力预实验。两种试剂盒获得的 PPB 值代表化合物的平均值，每个化合物均进行三次重复测定，分别在 3 个独立的孔板上进行孵育。最终 DMSO 浓度为 1%。

4.4 高结合率或 bRo5 化合物的血浆蛋白结合方法比较
对于高结合率小分子（图2A），改进的UC和HTD方法均能够测量18种受试化合物中12种的游离分数，且二者结果相差不超过两倍。

然而，一些异常值，例如拉帕替尼、芬戈莫德或伊曲康唑，似乎被UC方法高估，导致整体相关性较差（R² = 0.42）。相比之下，相同的方法对市售的bRo5肽（R² = 0.91）和内部肽（R² = 0.87）均获得了良好的相关性，但在该测试集中，游离结合率<1%的化合物数量相对较少（图2B）。

 

 

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对于所测试的降解剂，观察到中等相关性（R² = 0.68），总体而言，其在HTD法中的结合率低于UC法。这种系统性差异可能部分与所用基质不同有关，因为UC法是在稀释血浆中测试降解剂，而标准HTD法则是在未稀释血浆中进行比较。由于初步实验表明，所测试的降解剂溶解度高，非特异性结合（NSB）可忽略不计（因此添加0.01% Solutol®作为赋形剂并无益处），且由于在血浆中不稳定，16小时孵育后回收率降低（图4），因此未采用改进的HTD法。

使用人血清白蛋白(HSA) Transil 试剂盒和高灵敏度结合 (HSB) Transil 试剂盒分别测定了 12 种环状肽和 12 种高结合小分子的 PPB 值。用于评估高结合小分子PPB的HSB Transil试剂盒与文献值的相关性较差（R² = 0.36），仅有不到25%的化合物的PPB值与文献值相差在两倍以内。

这些结果表明，尽管已通过初步的膜亲和力实验确定了实验条件和用于获取最终数据的血浆稀释度，但该方法在获取可靠数据方面仍存在挑战。由于Transil HSB 试剂盒主要针对高结合范围（fu < 1%），但未能准确测量受试化合物的结合情况，因此该方法的可靠性较低，更成熟的 PPB 方法更受青睐。

4.5 降解剂回收率测量值可作为血浆稳定性的指标
对16种降解剂进行了血浆稳定性测定（图4），并与血浆蛋白结合率（PPB）数据进行比较。结果显示，人血浆（R² = 0.76）、小鼠血浆（R² = 0.94）和大鼠血浆（R² = 0.86）中的测定值之间存在显著相关性。大多数选定的降解剂在人血浆中的回收率均高于80%（16种化合物中有13种），而小鼠血浆（16种化合物中有2种）和大鼠血浆（16种化合物中有0种）中的回收率则低于80%。测定结果的高度一致性表明，当观察到低回收率与物种相关时（区别于物种无关的非特异性结合），PPB数据可以预测血浆不稳定性。

 

 

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5. PPB的测试方法决策树

图5展示了一个决策树，该决策树旨在根据化合物的具体特性，指导选择合适的方法来测量其游离百分比 (PPB) 。

 

 

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一旦确定需要蛋白质结合数据，建议首先使用HTD，该方法是目前公认的蛋白质结合分析（PPB）金标准方法，适用于大多数传统小分子化合物。对于HTD回收率低于50%或游离百分比为0%的化合物，可能需要采用其他PPB方法（例如UF或UC）来高置信度地测定蛋白质结合情况。

通常，HTD法会测试多种物种（图4）；不同物种间回收率的显著差异可能表明存在酶促降解或基质不稳定性。因此，决策树将回收率作为诊断触发因素：物种特异性的低回收率提示应从5小时HTD法转而采用快速UF法，以更准确地测定蛋白质结合情况。

如果多种物种的回收率相似且均较低，则可能表明存在非特异性结合（NSB）或HTD缓冲液中的溶解度问题。与HTD相比，超滤（UF）很少能解决非特异性结合（NSB）问题，除非添加赋形剂/对装置进行预涂层处理（例如Solutol®、Tween-80或苯扎氯铵），因此超速（UC）可能是一种替代解决方案。对于无法扩散穿过亲水性透析膜或超滤滤膜的高分子量疏水性化合物，超速也可作为首选方法.

当三种主要的PPB方法（HTD、UC和UF）的标准方案不适用时，可能需要进一步开发新方法。

如图2所示，对于高结合率化合物或bRo5化合物，使用正交方法（HTD与UC）可以提高对所测得的未结合分数值的置信度，大多数受试肽和降解剂的数值彼此相差不超过两倍，且两种方法测得的结合强度排序相似。

参考文献

1. Enlo-Scott Z, Dudal V, Gredelj M, Shanmugalingam T, Klammers F, Bassani D, Umehara K, Keemink J. A framework for plasma protein binding: Comparing methods for diverse small molecules and adapting for novel modalities. J Pharm Sci. 2026 Jun 17;115(9):104367. doi: 10.1016/j.xphs.2026.104367. Epub ahead of print. PMID: 42309206.

 

 

本文由广州佳誉医疗器械有限公司/佛山浩扬医疗器械有限公司联合编辑