介绍：

聚山梨酯（吐温，PS）是一类两亲性非离子表面活性剂家族，其中，聚山梨酸酯80（吐温80）是生物药物制剂中使用最广泛的“明星”表面活性剂，可防止蛋白质在储存、运输条件变性、聚集、表面吸附以及絮凝作用。吐温80是一种混合物，主要成分是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

作为常用的药物辅料，市售注射用吐温80主要有MC（多药典级）和CP（中国药典级）两种级别，其主要差异在油酸含量上，见表1。其中，CP级别常用供应商日油和南京威尔，MC级别有JT、Sigma和禾大等。

吐温80可以通过氧化和水解途径降解，见图1，其中水解反应是化学诱导的或酶催化的，氧化反应一般由化学诱导。吐温80作为生物制剂的一种保护剂辅料使用，但也可能影响蛋白质制剂的质量，从而对功效、安全性和稳定性起到不利作用。目前，药品监管部门对吐温80的控制要求越来越严格。

图1 吐温80的主要降解途径

有很多学者对吐温80进行了大量研究，下面从吐温80的优缺点、含量测定方法、以及面临挑战几个方面进行介绍。

吐温80的优点：

PS80是生物制剂中最常用的表面活性剂，在大多数商业治疗性蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂。这是由于以下因素：

1）生物相容性高；

2）低毒性；

3）有效的蛋白质稳定作用。即使在低浓度下（生物制剂中常用浓度为0.1-1.0mg/ml），它们也提供了足够的蛋白质稳定性。这是由于PS80的亲水亲脂平衡（HLB）值高和临界胶束浓度（CMC）低，PS80的CMC仅为1.4*10-2g/L。

蛋白质具有天然的不稳定性，易受到外部条件的影响，如温度、震荡、剪切力、缓冲体系及离子强度等，甚至自身的蛋白浓度或纯度的改变。其中，所有蛋白质变性降解的问题中，聚集的问题尤为严重。下游的制剂开发中常常使用吐温80作为蛋白的保护剂。聚山梨酯稳定蛋白质的机理，通常认为界面竞争和表面活性剂-蛋白质复合这两种主要机理。

吐温80主要通过界面竞争作用来稳定蛋白质，吐温80的表面活性比蛋白质（即单克隆抗体（mAbs））高很多，因此，吐温80可以竞争性地占据界面位置，抑制蛋白质吸附到气液交界面，进而减少与空气接触造成的氧化或聚集，也有效防止蛋白质在制造过程、样品处理和存储中在界面处展开。

吐温80还可以通过与蛋白质直接相互作用，增加蛋白质的胶体稳定性。抗体可能会通过其分子间输水作用形成聚集体。吐温80可通过与蛋白质表面上的疏水相互作用，从而防止蛋白质聚集甚至颗粒的产生。

吐温80的缺点：

前面提到吐温80其实是一种混合物，市售的预期结构聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯）仅占吐温80总量的20％。如图2所示，异质性主要来来源与工艺相关的副产物杂质，其中不仅含有单酯（预期结构），还含有二酯、多酯，甚至未成酯的脂肪酸链。此外，前面还提到（见图1），吐温80可以发生水解反应及氧化反应导致降解，产生脂肪酸链及氧化物，以上导致对吐温80的表征成为了难点。

图2 吐温80主要的化学结构

吐温80的表征：

吐温80的结构缺乏强发色团，无法直接检测到容易获得的紫外可见光及荧光。目前，很多研究学者已经开发了多种表征方法来控制吐温80的不同性质，表2总结了几种常见含量检测方法的原理及优缺点。然而，由于不同亚种（如未酯化、单酯、多酯）及降解产物（如水解、氧化）对总吐温80含量结果的贡献值存在显著差异，因此用不同原理方法测定的吐温80含量显示出明显的差异。

此外，还采用MS或CAD（其中主要应用色谱与MS联合应用）来分析主要吐温80亚种的组成及降解物，例如小的有机分子，游离脂肪酸等，研究解聚山梨酯降解途径。药典方法、HPLC-ELSD/CAD方法对水解产物较为敏感，HPLC-FMA也可测出样品水解，然而测定吐温80氧化方面上，FMA方法更胜一筹，综合来看，HPLC-FMA方法更适用于PS80含量的检测。截止目前为止，吐温80的表征方法层出不穷，但具有各自方法的优点及弊端，其仍然是一项分析挑战，必要时可采取多种检测方式共同评价。

面临的挑战：

吐温80的水解也就是酯的水解，反应生成的游离脂肪酸链可形成聚集甚至可见颗粒，并且可能与蛋白结合形成脂肪酸-蛋白复合物。在典型的蛋白质制剂pH（4-7）下，吐温80的水解受到限制。有文献表明，酶诱导的吐温80水解是影响产品质量的可见和亚可见颗粒形成的主要原因，实际生产中上游工艺带来的Hcp脂肪酶是催化PS80水解的一个重要因素，其具有与目标蛋白相似的理化性质，因此很难完全去除。即使优化纯化工艺去除Hcp，但远低于检测限的极少量Hcp（ppm级别）也可催化PS80的水解。

吐温80可能被光照、温度，过氧化物、氧气或痕量金属离子等影响因素氧化，氧化位置常见脂肪酸链双键、母核的醚键和部分酯键，降解产物有自由基、过氧化物、游离脂肪酸、短链烷烃、醛、酮、酸等。而生成的过氧化物可能继而引起蛋白质氧化。

泊洛沙姆188（P188）是另一种在蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂的赋形剂，尽管不如吐温80使用广泛。P188因不具备酯键，不会有发生水解的风险，主要通过氧化形式在溶液中降解，形成氧化的聚氧乙烯（POE）和聚环氧丙烷（PPO）。但P188在上市品种中应用局限，可能存在长期放置过程中潜在风险。

因此，推荐使用一些手段减少吐温对蛋白质的负面影响，如2-8℃低温储存、充氮、避光保护；通过上游工艺优化降低Hcp；加入抗氧化剂、金属络合剂等。其中抗氧化剂如甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸等，金属络合剂如EDTA、DTPA等。

参考文献：

[1] Characterization of Polysorbate 80 by Liquid Chromatography Mass Spectrometry to Understand Its Susceptibility to Degradation and Its Oxidative Degradation Pathway Journal of Pharmaceutical Sciences 111 (2022) 323−334;

[2] Characterization of Polysorbate Ester Fractions and Implications in Protein Drug Product Stability Mol. Pharmaceutics 2020, 17, 2345−2353;

[3] Degradation of polysorbates 20 and 80 catalysed by histidine chloride buffer European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 154 (2020) 236–245.

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