很多无菌医疗器械产品在放行过程中会对产品的无菌性进行控制，在检查要点指南里也指出，作为无菌医疗器械生产企业，其无菌检验工作应由本企业独立完成，因此在产品技术要求制定过程中要考虑产品无菌检查的方法是否符合产品的控制要求，所采用的无菌检查方法应适合于该产品的无菌检查，能够给出正确的结果。

医疗器械的无菌检查方法适用性试验一般依据《中国药典》2020年四部通则1101“无菌检查法”、GB/T14233-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法》以及北京市医疗器械无菌检验检查要点指南（2023版）进行开展。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。下面分享一个敷料产品的无菌方法适应性试验案例和大家一起共同探讨方法建立的过程。

1、设备及器具：

集菌仪、培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、生物安全柜、电子天平等。

平皿、烧杯、三角瓶、输液瓶及配套瓶塞、接种环、集菌培养器、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、一次性注射器等。

2、稀释液及冲洗液：

稀释液pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

3、试验用菌株名称和编号：

以上菌株由中国药品生物制品检定所提供。

4、菌液制备

①取经30～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨液体培养基培养物1ml，加入至9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至10-9约为不大于100cfu/ml的菌悬液，备用。

②取经30～35℃培养18～24h的大肠埃希菌胰酪大豆胨液体培养物1ml，加入至9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至10-7约为不大于100cfu/ml的菌悬液，备用。

③取经30～35℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养物1ml，加入至9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至10-7约为不大于100cfu/ml的菌悬液，备用。

④取经30～35℃培养18～24h生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入至9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至10-6约为不大于100cfu/ml的菌悬液，备用。

⑤取经20～25℃培养2～3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物1ml，加入至9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至10-7约为不大于100cfu/ml的菌悬液，备用。

⑥取经20～25℃培养5～7天获得丰富孢子的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。用管口带有薄的无菌棉花的无菌注射器吸取1ml，加入至9ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至10-5约为不大于100cfu/ml的孢子悬液，备用，计数结果见下表。

试验菌名称

稀释度

菌落计数（cfu/ml）

金黄色葡萄球菌

10-9

85

83

大肠埃希菌

10-7

77

79

枯草芽孢杆菌

10-7

65

72

生孢梭菌

10-6

58

51

白色念珠菌

10-7

80

72

黑曲霉

10-5

66

70

菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用，黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用，本实验所有菌悬液均为当天使用。

5、供试液的制备及处理

取供试品10个，每个剪取约9cm2至烧杯中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200ml（每9cm2样品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml），振摇使其全部浸泡，37℃水浴浸提1小时，取全部浸提液作为供试液，按《中国药典》2020版四部通则1101“无菌检查法”检查，采用薄膜过滤法，过滤3个滤筒，每滤筒冲洗3次，每次100ml，冲洗液为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。在最后一次冲洗液中分别加入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌，加硫乙醇酸盐流体培养基至滤筒内。白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌按同法操作，加胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。

阴性对照：以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液和供试品，接入规定量培养基，置规定温度培养，培养时间不得超过5天。

阳性对照：取一装有同体积的培养基的容器加入等量试验菌，作为阳性对照，置规定温度培养，培养时间不得超过5天。

样品管及对照管培养记录见下表。

培养基 试验菌株 试验组 培养时间（天）
1 2 3 4 5
硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色 A 样+菌 + + + + +
葡萄球菌 菌 + + + + +
B 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
C 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
大肠 A 样+菌 + + + + +
埃希菌 菌 + + + + +
B 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
C 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
生孢梭菌 A 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
B 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
C 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
阴性对照 - - - - -
胰酪大豆胨液体培养基 白色 A 样+菌 + + + + +
念珠菌 菌 + + + + +
B 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
C 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
黑曲霉 A 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
B 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
C 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
枯草 A 样+菌 + + + + +
芽孢杆菌 菌 + + + + +
B 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
C 样+菌 + + + + +
菌 + + + + +
阴性对照 - - - - -

6、结果判断：阴性对照无菌生长，与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查可行。

7、结论评价

根据上述验证试验结果表明，采用薄膜过滤法，所有试验菌株均能在实验组、阳性对照组中生长良好，并且与阳性对照组比较，所有试验菌株在产品实验组中出现生长的时间均无明显差异。产品该检验量在该检验方法下无抑菌作用。因此该敷料产品的无菌检查依据《中国药典》2020版无菌检查法中的薄膜过滤法进行检验。每滤筒冲洗3次，每次100ml，冲洗液为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌。

本文由广州佳誉医疗器械有限公司/佛山浩扬医疗器械有限公司联合编辑