液相色谱柱作为液相系统的核心部件，也是我们日常分析中的关键组成部分，且价格相对昂贵。若能采用正确的方法使用和维护，就可以延长其使用有效期，在保障分析工作质量的同时有效节约成本。

1.反相柱

反相色谱柱常见键合相包括：C18（十八烷基）、C8（辛烷基）、C4（四碳链）、Phenyl（苯基）、PFP（五氟苯基硅胶）等。

1.1活化平衡

（1）在新色谱柱刚开始启用时，从报告证书中获取色谱柱出厂时的储存溶剂等信息，使用与储存溶剂相溶的流动相（如甲醇、甲醇水、乙腈、乙腈水等）活化色谱柱至少20倍柱体积，活化时的初始流速一般较低，推荐0.2~0.5ml/min。

（2）在进行分析之前，请使用合适比例的水相（例如：10%的甲醇水或者10%的乙腈水溶液）或不含盐的流动相平衡柱子至少20倍柱体积，以使色谱柱达到平衡。

1.2使用或清洗

（1）使用完成后，用至少20倍柱体积的高比例水相（含有≥50%水的极性有机溶剂，如10%的甲醇水或者10%的乙腈水溶液）作为流动相以除去柱子中的缓冲盐。若流动相中不含缓冲盐，可取消此步骤。

（2）使用至少20倍柱体积的含有高比例有机相（含有≥80%有机溶剂，如80%的甲醇水或者80%的乙腈水溶液）清洗柱子。

（3）污染物的去除：常规清洗后柱效没有明显恢复时，可以使用50%异丙醇/乙腈溶液以低流速（不要超过色谱柱的最大耐受压力）清洗至少20倍的柱体积以去除污染物。

1.3 保存

清洗完成后，推荐将反相色谱柱保存在高比例的有机相中，如有机相（甲醇/乙腈）-水=80:20

1.4 使用注意事项

（1）不能超出色谱柱耐受的pH使用。

（2）使用时，色谱柱的温度不能超过说明书的使用范围，一般是60℃。

（3）使用前，需要观察流动相的状态，不能使用长菌的流动相，流动相使用前需过滤。

（4）如果流动相有超过95%的水相，推荐使用耐水的键合相，保证进样重复性。

2. HILIC色谱柱

常见的HILIC色谱柱有：纯硅胶柱、氨基柱（用于HILIC模式）、二醇基柱、酰胺基柱等

2.1活化平衡

（1）使用50倍柱体积的50/50的乙腈/水相缓冲溶液（缓冲液的最终浓度为10mM，如甲酸铵、乙酸铵等）平衡新色谱柱。（需提前查阅说明书，若溶剂不相容，需要提前采用合适的溶剂过渡。）

（2）在开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相平衡色谱柱。

2.2 清洗和再生

当使用过程中，色谱柱的压力骤然升高，保留时间或分离度改变时，往往表明色谱柱被污染了。可用50/50的乙腈/水清洗以去除极性污染物。如果清洗无效，可用更低比例的乙腈/水（40:60）清洗色谱柱。如果色谱柱压力过高或色谱峰分叉，通常代表需要更换新色谱柱。

2.3 保存

（1）如果短时间内不使用色谱柱，可以将其将其保存在与流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液（不含酸、无机盐）中。

（2）较长时间内不使用色谱柱（超过四天），请将柱子保存在95％乙腈中；如果流动相中含有缓冲盐，先用与流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液（不含酸、无机盐）冲洗色谱柱10倍柱体积，然后换上95％乙腈保存。

2.4 注意事项

（1）流动相中水相的比例不能低于3%，一般保持5％的极性溶剂（如5％水相缓冲液，5％甲醇或3％甲醇+2%水相缓冲液等），保证HILIC硅胶填料始终被水浸润。

（2）在流动相或梯度中至少保持有机溶剂（如乙腈）的比例不低于40％

（3）因为磷酸盐在高比例有机相中易析出，不推荐使用磷酸盐体系，但可以使用磷酸。

（4）甲酸铵或乙酸铵水溶液缓冲系统比甲酸或乙酸的水溶液重现性更好。如果不能使用缓冲液而一定要使用流动相添加剂如甲酸，最好使用0.2%的浓度而非0.1%。

（5）为得到最好的峰形，在流动相或梯度中总是保持缓冲系统的浓度为10mM。

（6）如果可能，尽量用100％乙腈溶解样品进样。避免使用水配制样品溶液。最常用的进样溶剂为75/25 乙腈/甲醇。

（7）不要用水或DMSO做稀释剂，它们将导致峰形变得很差

（8）请确保洗针溶剂/冲洗溶剂包含和流动相一样的高比例有机相，否则峰形会受到影响。

（9）进行梯度分析时，进样间隔需要用10倍柱体积起始流动相平衡色谱柱，色谱柱平衡不充分将导致保留时间漂移。

3. 正相色谱柱

常见的正相色谱柱有：氨基柱（正相模式）、硅胶柱等。

3.1 活化平衡

（1）首先需要确认保存溶剂，正相色谱柱通常都保存在正己烷等非极性溶剂中。使用前需检查柱内保存溶剂与目标流动相的相溶性，若不能互溶，需要使用过渡溶剂（如乙酸乙酯、二氯甲烷等）逐步进行转换。

（2）新柱使用前需用流动相平衡20-30个柱体积，以去除保存溶剂并使填料达到稳定状态。

3.2 清洗和再生

（1）清洗：实验结束后，用流动相冲洗色谱柱10-20个柱体积，去除残留样品和杂质。若使用含盐流动相，需先用不会盐的流动相冲洗足够的体积，再用有机溶剂冲洗。

（2）再生处理：若柱效下降，可尝试用正己烷→氯仿→二氯甲烷→异丙醇→正己烷的顺序反向冲洗，每次20个柱体积，以去除吸附杂质。

3.3 保存

短期保存（隔夜或周末）可使用当前流动相保存；长期保存需用正己烷或异丙醇等非极性溶剂，避免柱床干燥或固定相水解。

3.4 使用注意事项

（1）初始流速宜低（如0.2ml/min），待柱压稳定后再逐步增加至目标流速，避免压力突变损伤填料。

（2）正相色谱一般不使用缓冲盐，若需使用，需严格控制浓度和pH，并在实验后彻底冲洗。

（3）需要适配合适的正相系统（如流动相管路等）。

4. 离子色谱柱

例如Thermo的BioBasic AX,SCX,Hypersil SAX,Hypersil Gold AX SAX等系列色谱柱。

4.1 色谱柱活化

（1）新柱在使用前，请预先用20倍柱体积甲醇/或乙腈冲洗色谱柱，然后以初始流动相（不含盐）冲洗10倍柱体积。

（2）在进行正式分析之前，请使用至少20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，以使色谱柱达到平衡。

4.2 清洗和再生

（1）常规清洗：每天完成分析之后，用100%水冲洗30 倍柱体积除盐，然后用20%甲醇/或乙腈冲洗20个柱体积，保存在20%甲醇/或乙腈中。

（2）清洗强保留污染物：如果发现离子交换色谱柱柱效出现大幅下降，可通过如下方法清洗离子交换色谱柱：首先用高浓度的缓冲盐溶液清洗（浓度是流动相的5-10倍，但不得超过1M），冲洗30倍柱体积。用100%水冲洗20倍柱体积以除盐后，再用100%甲醇/或乙腈清洗30倍柱体积。最后用20%甲醇/或乙腈水溶液（不含盐）保存。

4.3 保存

用100%水冲洗30倍柱体积除盐后，若短期不使用（<1周），用20%甲醇/或乙腈冲洗20倍柱体积后，保存在20% 甲醇/或乙腈中；若需长期放置（>1周），用50%甲醇/或乙腈冲洗20倍柱体积后，保存在50%甲醇/或乙腈中。

4.4 注意事项

（1）流动相中使用使用高纯度试剂（优级纯或色谱纯）配制淋洗液，使用电阻率≥18.2MΩ·cm的超纯水。

（2）离子色谱柱使用是最后搭配保护柱使用。

目前色谱柱的种类繁多，除了上述提到的类型外，还有例如凝胶色谱柱、GPC分析用色谱柱、双重混合模式色谱柱等，对于不同的色谱柱，其使用、维护和保存都有其特殊要求，在日常使用中，我们应注重其使用说明书的相关要求，用正确的方法使用，在保障效率的同时最大程度的节约成本。

本文由广州佳誉医疗器械有限公司/佛山浩扬医疗器械有限公司联合编辑