2019年11月28日，来自美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学研究所的Roderick MacKinnon教授带领的团队Cell 杂志上发表题为“Voltage Sensor Movements during Hyperpolarization in the HCN Channel” 的长文，他们利用金属交联技术结合冷冻电镜技术确定了HCN通道在超极化状态下构象的具体结构，并发现了超极化下S4螺旋运动的具体机制。

美学者发现起搏器通道在超极化下S4螺旋运动的具体机制

目前，有关于超极化门控离子通道的研究还很少。HCN通道中的四个相同的电压传感器的结构与去极化门控通道中的电压传感器很相似。尤其是，S4螺旋上每三分之一位置携带的正电荷氨基酸和门控电荷转移中心（正电荷通过它在膜上的传递是守恒的）这些基本特征都是相似的。虽然所有的电压传感器在结构上都是相似的，但是它们附着在孔隙上的方式是可变的。到目前为止，电压门控离子通道可分为两类：结构域交换和非结构域交换。结构域交换指的是电压传感器靠在由相邻亚基构成的孔隙单元上，Na+、Ca2+和Kv1-Kv7 K+通道都具有结构域交换的电压传感器。结构域交换需要一个S4-S5连接螺旋，与膜平面平行；连接螺旋共有四个，每个亚基一个，环绕孔隙的门。S4-S5连接器被认为是一个杠杆，能将S4螺旋运动转移到门上（图一）。

美学者发现起搏器通道在超极化下S4螺旋运动的具体机制

HCN通道中的电压传感器不是结构域交换的，因此不存在螺旋型S4-S5连接器。因此，在HCN通道中，S4螺旋传递到孔隙的运动方式肯定是不同的。需要明确的是，一个非结构域交换的离子通道不一定要在膜超极化时打开。例如电压门控的K+通道Kv10-Kv12和HCN通道一样，属于非结构域交换的电压传感器，但是它们在膜去极化时打开。因此，HCN是一个不同于已经熟悉和广泛分析的电压门控Na+、Ca2+和K+通道的电压门控通道。首先，HCN通道在膜超极化时打开，其次，电压传感器不是结构域交换的。那么，在HCN通道中，S4螺旋传递到孔隙的运动方式到底是怎样的呢？

在没有外加电场的情况下，HCN通道中的电压传感器采用去极化时的构象，孔隙闭合。既然要研究HCN通道在超极化构象下打开孔门的机制，第一步就是获得稳定的超极化构象结构。使用传统的化学交联剂来稳定构象的尝试都会因交联的位置而产生偏差。本文最终引入金属亲和交联法，利用离子通道的方法来测试当通道门打开时，通常彼此接近的位点之间是否形成了化学交联。在电生理试验中实时监测交联的形成速率。如果交联键的生成速率是以通道门控时间尺度依赖的方式，并被控制门控的相同的变量所调控，那就说明，交联的位点由孔门临近的残基形成。作者在早期研究的基础上，将半胱氨酸残基引入门控电荷转移中心（一个位于电压传感器中心的氨基酸群，包括一个苯丙氨酸和几个带负电荷的氨基酸）区域两个相互接近的位置。在该研究中，他们提出，当S4螺旋移动时，精氨酸或赖氨酸残基进入电荷转移中心，一次一个，并穿过膜。在HCN通道中，S4上的“每第三位”氨基酸之一（几乎总是精氨酸或赖氨酸）恰好是丝氨酸。于是他们将丝氨酸突变为半胱氨酸（S264C），并将门控电荷转移中心的一个残基突变为半胱氨酸（F186C）。在去极化HCN通道的结构中，这些氨基酸被完美地分离了15个Å。然后他们检测这个双半胱氨酸突变是否能引入门控-状态依赖的金属亲和力交联。在全细胞膜片钳记录中，HCN突变体F186C/S264C通道以电压和时间依赖的方式打开孔门，这与野生型HCN通道类似。在这些实验中，细胞膜一开始保持在0 mV（能令通道关闭的电压）。当膜超极化时，HCN通道以时间依赖的方式打开。但是，当向细胞外溶液中加入100 mM镉离子（Cd2+）时，依赖于时间的门控消失，通道似乎被锁在了打开状态。当Cd2+从溶液中移除时，通道恢复到野生型门控行为。这些影响取决于在186和264位置的半胱氨酸残基。交联的形成是依赖于孔门状态的，并且与通道门控时间尺度相一致。在该实验中，Cd2+被使用了两次。在第一次添加时，细胞膜保持在0 mV，经过两次脉冲，几乎所有通道都被锁定打开。在清洗后第二次添加Cd2+时，只有30%的通道在第一次开始脉冲时被锁定打开。这些结果表明，当超极化打开通道时，Cd2+交联迅速发生，而当通道关闭时，其交联速度要慢得多。近80%的交联反应发生第一次添加Cd2+的第一次和第二次脉冲之间。这些实验结果说明，Cd2+交联的形成发生在通道打开的时间尺度上。

满足这些标准后，他们表达并纯化半胱氨酸突变体通道，并在Hg2+存在下利用冷冻电镜术（Cryoelectron microscopy,cryo-EM）测定其结构。与野生型HCN通道结构相比，S4螺旋向细胞质侧移动，即从264位置到靠近门控电荷转移中心的186位置。这种交联稳定的通道与超极化膜电压下的构象相似，被称为“超极化通道”或“超极化构象，”。也把在0 mV下没有交联的野生型通道称为“去极化通道”。

去极化状态下HCN通道S4螺旋从原来的位置移动到新位置的时候会发生二次结构变化。作者发现，S4移动过程中，310螺旋虽然仍保持在膜的中心附近不变，但是在两种结构中由不同的氨基酸形成。当螺旋从胞外向胞内移动时，靠近细胞外表面的α螺旋的氨基酸必须重组到310螺旋里面。同时，当氨基酸从310螺旋开始接近细胞内表面时，它们又必须重组成一个α螺旋。之前也发现，在单个Kv结构中也有从α螺旋到310螺旋的转变，称之为“手风琴样效应”（concertina effect）。许多电压传感器中都能观察到310螺旋。310螺旋使S4螺旋上的带正电荷的氨基酸以每次三个周期性的方式离开脂质环境，进入膜中央附近的门控电荷转移中心，在那里，未屏蔽电荷的静电不稳定性最大。310螺旋比α螺旋缠绕得更紧，并与更高的能量消耗有关。310螺旋在S4位置上的动态移动很完美的解释了S4螺旋上每三分之一处的正电荷的作用。

随着S4向超极化构象的位移，门控电荷转移中心上方的两个精氨酸残基R3 （Arg267）和R4 （Arg270）移动到下方。作者还观察到，S4螺旋分裂成两个螺旋。包含R4的上半部分螺旋，仍然垂直并穿过膜；R4下面部分的螺旋，则几乎变得细胞内膜表面平行。螺旋断口处由Ser272的侧链进行稳定，它与Leu269的羰基氧形成氢键，从而覆盖了S4垂直段的末端。S4的水平段将R5和R6的侧链导向细胞内溶液，同时，它将几个亲脂侧链指向脂膜，将色氨酸指向膜-水界面。将去极化构象中的单个的长的跨膜S4螺旋转化为两个分离的超极化构象螺旋，可以明显地减少将部分S4插入到细胞内的水溶液中所带来的能量损失。而精氨酸和赖氨酸残基在水环境中更稳定（能量低）。在此构象中，S4的c端在内膜表面形成一个界面螺旋，似乎在这些有利的和不利的相互作用之间达到了某种平衡。

最终的结果是，S4的新构象使S5螺旋从S6螺旋束上位移一段距离，形成了孔隙的门。为了进一步确认在超极化通道中观察到的S5的位移是否与孔隙打开有关，作者构建了一个突变体Y289D的结构，该突变体在0 mV时具有很高的打开概率。该突变体的电压传感器采用了与野生型类似的去极化构象，结果表明，S5螺旋与超极化通道中相对S6螺旋的偏移方向与野生型相同，只是程度较轻。这两者中S5的相似偏移表明，S4通过S5相对于S6的位移来控制HCN通道的门。

研究发现，HCN通道在超极化时，S4螺旋从胞外膜表面运动到胞内电荷转移中心是一个从α螺旋到310螺旋再到α螺旋的过程。在此过程中，310螺旋的位置不变，但是组成的氨基酸成分随着α螺旋的氨基酸的进入和离开发生变化。同时，S4螺旋会断裂成两部分，上面垂直部分保持不变，R4精氨酸残基下面的部分则由原来的垂直变成与胞内膜表面平行。这种改变使得临近的S5螺旋改变与S6螺旋的相对位置，从而打开孔门（图二）。这种α螺旋与310螺旋这种双螺旋特性是否也是其他非结构域交换电压门控通道的特征，还是仅仅是超极化门控通道的特征，还有待观察。总之，这篇文章揭示了以前未知的关于HCN通道电压传感的机制。以及，不同通道的电压传感器可能不会发生相同的构象变化。

美学者发现起搏器通道在超极化下S4螺旋运动的具体机制

关于起搏器通道

电压依赖蛋白通过改变自身构象来对细胞膜上的电压变化做出反应。这个过程由电压传感器介导，该传感器是一种有四个跨膜螺旋结构域的蛋白。在电压门控的离子通道中，电压传感器控制孔的门。大多数电压门控离子通道，例如Na+、Ca2+和Kv1-Kv7 K+通道，在细胞膜去极化时打开（即当细胞膜内的电压相对于细胞膜外为正时，静息状态下细胞膜电位外正内负）。关于这类电压门控通道的研究主要集中在机械力学上。超极化激活的环核苷酸门控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gatedchannel, HCN channel）是一种罕见的电压门控阳离子通道，在细胞膜超极化时（即当细胞膜内的电压相对于细胞膜外为负时），该通道就会打开。此属性赋予HCN通道具有起搏器的活性，所以有时又被称为起搏器通道。HCN通道位于心脏和神经系统中，通过起搏器行为控制生理过程。

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